Лечение онкологических заболеваний человека и животных в значительной степени базируется на применении химиотерапевтических препаратов, а в некоторых случаях они являются единственно возможным и эффективным способом лечения и спасения жизни пациентов. Успех и выбор терапии во многом зависят от целого ряда факторов, в частности от механизма противоопухолевого действия отдельных групп препаратов, которые включают, не ограничиваясь этим, алкилирующие агенты, антиметаболиты, блокаторы митоза (антитубулины), противоопухолевые антибиотики, гормональные препараты, иммуномодуляторы, вакцины и др.

Разнообразие противоопухолевых агентов включает препараты синтетического и природного происхождения, список которых постоянно обновляется и пополняется в результате новых достижений научных исследований.

При выборе конкретного препарата, а также схем и режимов его применения для конкретного показания учитывается не только эффективность, но и переносимость химиотерапии у пациентов, поскольку большинство противоопухолевых средств проявляют целый ряд выраженных системных и местных побочных эффектов. В некоторых случаях такое побочное действие приводит к невозможности применения или полному отказу от эффективной химиотерапии, даже несмотря на высокий терапевтический эффект. В связи с этим препараты природного происхождения представляют особый интерес в качестве потенциальных лекарственных средств с учетом их более физиологичного воздействия на организм пациентов.

Исходя из вышеизложенного, остается актуальной необходимость в разработке новых, более совершенных противоопухолевых биологических препаратов, которые сочетали бы в себе высокую эффективность и низкую токсичность.

В ряде публикаций описано антипролиферативное действие личинок T. spiralis в условиях in vitro и in vivo. Имеются данные об антипролиферативном действии метаболитов трихинелл, в частности экскреторно-секреторных белков.

Большой интерес представляют работы сотрудников ВНИИП им К.И. Скрябина, результаты которых свидетельствуют о выраженном антипролиферативном действии соматического белкового экстракта T. spiralis на различных опухолевых моделях in vitro.

С учетом планируемых дальнейших испытаний данного продукта in vivo, выяснения механизма действия и возможного применения в качестве оригинального лекарственного средства необходима детальная характеристика, включающая оценку многих биологических свойств данного экстракта на животных моделях. В частности, установлены особенности антипролиферативной активности in vitro экстракта личинок трихинелл, полученных от экспериментально зараженных крыс на разной стадии инвазии. Проведена оценка влияния экстракта на эмбриональное развитие крыс, результаты которого свидетельствуют об отсутствии каких-либо негативных эффектов.

Важным аспектом является оценка влияния экстракта на иммунный статус, в частности на гуморальное и клеточное звено иммунитета.

Цель настоящего эксперимента — исследование иммунотропной активности белкового экстракта Т. spiralis после однократного и многократного введения мышам в сравнении с заражением Т. spiralis.

Материалы и методы исследования

Исследования выполняли в лаборатории экспериментальной терапии, виварии ВНИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К. И. Скрябина (г. Москва, Россия) и виварии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования Минздрава России» (г. Москва, Россия) в 2024 г., проводили на мышах CBA × C57BL/6 и аутбредных крысах, которых получали из питомника «Филиал “Андреевка”» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России» (Московская обл., Россия).

Белковый экстракт получали из личинок трихинелл, выделенных из тушек аутбредных зараженных крыс-самок, которых заражали личинками T. spiralis внутрижелудочно с использованием общепринятого метода из расчета 10 личинок на 1 г массы тела. Экстракт готовили, как описано в патенте 2 671 632 РФ. Кратко: выделенные инвазионные личинки помещали в физиологический раствор и измельчали при 0 ºС до получения однородной массы. Экстракцию проводили в течение 12–16 ч. на магнитной мешалке. После окончания экстракции суспензию центрифугировали при 18 000 об/мин в течение 1 ч. на холоде. Осадок удаляли. Супернатант использовали в качестве белкового экстракта.

Исследование иммунотропного действия белкового экстракта проводили на 113 мышах-самцах CBA × C57BL/6 массой 18–20 г. Экстракт вводили однократно и шестикратно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/животное. Показатели иммунного ответа определяли в сравнении с заражением личинками T. spiralis (10 личинок на 1 г массы тела), как описано выше для крыс. Все эксперименты с животными проводили с соблюдением биоэтических норм.

Для оценки первичных и более отдаленных эффектов иммунотропное действие оценивали через 8 суток и 21 день после введения экстракта после однократного и последнего шестикратного введения экстракта, и таким образом были сформированы следующие группы:

— 1-я группа — оценка влияния исследуемых агентов на гуморальный иммунитет в реакции гемагглютинации (на 8-е сутки после заражения личинками трихинелл; на 8-е и 21-е сутки после однократного введения или последнего шестикратного введения белкового экстракта). Это группа, включающая несколько подгрупп. Часть животных подвергали эвтаназии через 8 суток после однократного или последнего шестикратного введения экстракта, а часть — через 21 день;

— 2-я группа — оценка влияния исследуемых агентов на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (на 8-е сутки после заражения личинками трихинелл; на 8-е и 21-е сутки после однократного введения или последнего шестикратного введения белкового экстракта);

— 3-я и 4-я группы — контрольные животные (внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объеме 0,5 мл/животное в указанные сроки) для каждого вида иммунологических реакций (РГА и РГЗТ).

Показатели гуморального и клеточного звена иммунной системы при воздействии личинок трихинелл или его белкового экстракта оценивали с использованием модели антигенной стимуляции. В день заражения личинками трихинелл и в день однократного и последнего шестикратного введения испытуемого экстракта мышей всех опытных и контрольных групп иммунизировали внутрибрюшинно 3%-ной взвесью эритроцитов барана (ЭБ) (тест-антиген) в стерильном физиологическом растворе в объеме 0,5 мл.

Влияние заражения личинками T. spiralis и введения белкового экстракта на гуморальный иммунный ответ определяли в прямой реакции гемагглютинации (РГА); на клеточный иммунный ответ оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ).

Приводим краткое описание постановки использованных тестов.

Реакция гемагглютинации, когда титр антител определяли в микроварианте прямой реакции гемагглютинации (РГА) и выражали в виде log2 числа. Для сравнения выраженности иммунного ответа в опыте и контроле определяли индекс реакции (ИР), который представляет собой отношение титра антител в опыте к величине титра антител в контроле. Значение индекса 0,5 и ниже свидетельствует об угнетении антителогенеза, 1,3 и выше — о стимуляции иммунного ответа.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа. Влияние на Т-клеточный иммунитет in vivo оценивали у мышей по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к ЭБ. В день заражения личинками трихинелл, в день однократного введения и последний день шестикратного введения испытуемого белкового экстракта всех животных, включая группу контрольных животных, иммунизировали 3%-ной взвесью ЭБ внутрибрюшинно и разделяли на четыре группы (4-я группа — контрольные животные). На 5-е сутки после иммунизации для выявления сенсибилизации мышам в подушечку правой задней лапки вводили разрешающую дозу 15%ной взвеси ЭБ в объеме 0,02 мл, в контралатеральную — физиологический раствор в том же объеме. О степени выраженности воспалительной реакции в месте инъекции разрешающей дозы антигена судили по приросту массы лап через 24 ч., об интенсивности клеточной реакции ГЗТ — по величине сдвига индекса реакции по формуле:

Гистологические исследования. В одном варианте опыта (на 8-е сутки после однократного и последнего шестикратного введения белкового экстракта) после эвтаназии дислокацией шейных позвонков у 3 опытных и 3 контрольных мышей отбирали образцы органов (селезенки, тимуса, лимфатических узлов, печени), принимающих участие в функционировании иммунной системы. Материал фиксировали в 10%-ном формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы делали на микротоме Microm HM325 (Германия) и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопические препараты исследовали под микроскопом Levenhuk 625 (Россия), увеличение 90 × 10.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Гуморальный иммунный ответ. Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности агглютининов, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных ЭБ животных, «склеивать» ЭБ, используемые для иммунизации.

Результаты оценки гуморального иммунитета представлены в таблице 1.

Анализируя полученные данные, следует отметить, что при исследовании сывороток контрольных животных значения титров антител установлены на уровне 7,10 ± 0,50 и 7,66 ± 0,60 (log2), соответственно, на 8-е и 21-е сутки.

На 8-е сутки после введения личинок T. spiralis имело место незначительное снижение титра агглютининов в сыворотке крови мышей (6,00 ± 0,26). На этот же срок после однократного и шестикратного введения белкового экстракта трихинелл титры агглютининов относительно контроля снизились (соответственно, до 6,30 ± 0,42 и 5,50 ± 0,60).

Однако во всех случаях можно говорить только о тенденции к угнетению антителогенеза, поскольку различия не были статистически достоверными. Подтверждением этому служат значения индекса реакции, которые в опыте находились примерно на одном уровне (0,84, 0,88 и 0,77).

На 21-е сутки после однократного и последнего шестикратного введения антигена (экстракта Т. spiralis), титры агглютининов у опытных и контрольных животных находились на одном уровне и не имели различий. Значения ИР составили 1,00 и 0,95.

Таким образом, на 8-е сутки имело место некоторое угнетение продукции агглютининов под действием личинок трихинелл и их соматического экстракта; однако к 21-м суткам показатели антителообразования у опытных и контрольных мышей были сравнимы между собой.

Клеточный иммунный ответ. Результаты оценки клеточного иммунитета представлены в таблице 2.

На 8-е сутки заражение личинками T. spiralis и шестикратное введение белкового экстракта T. spiralis не оказало влияния на клеточное звено иммунитета. Однако после однократного введения экстракта имела место тенденция к ослаблению воспалительной реакции (3,44 ± 0,78% у опытных животных относительно 5,17 ± 0,76% у животных контрольной группы).

На 21-е сутки можно отметить угнетение клеточного иммунитета как после однократного, так и после шестикратного введения экстракта трихинелл, и восстановление показателей можно ожидать в более поздний срок.

Однако следует отметить, что в обоих случаях (то есть на 8-е и 21-е сутки) статистически значимые различия между опытом и контролем отсутствовали, и имела место очевидная тенденция к угнетению клеточного звена иммунитета.

Гистологические исследования. После однократного введения белкового экстракта трихинелл были выявлены гиперемия в лимфоидных органах и лимфоузлах, уменьшение паракортикальной зоны по сравнению с контрольной группой.

При шестикратном введении экстракта в мезентериальных лимфатических узлах было отмечено снижение количества и размеров лимфоидных фолликулов, встречались дегенерирующие лимфоциты и фагоцитирующие их макрофаги, большинство фолликулов было без герминативных центов (первичные). Герминативные центры являются центрами реакции на токсические вещества и формируются под влиянием чужеродных веществ как центры пролиферации В-лимфоцитов, в данном случае наблюдалось угнетение иммунного ответа в В-зоне. Атрофия лимфоидной ткани, возможно, связана с апоптозом лимфоцитов в коре узла.

В селезенке мышей после шестикратного введения испытуемого экстракта отмечены сокращение площади белой пульпы (визуально), увеличенные очаги кроветворения с присутствием гигантских клеток мегакариоцитов и других предшественников V класса гемопоэза. Были обнаружены апоптотические тельца, окруженные макрофагами, однако заметной пролиферации (разрежения герминативных центров) не наблюдалось.

По результатам проведенного гистологического исследования можно сделать вывод об очевидном иммуносупрессивном действии белкового экстракта T. spiralis.

Подведем итоги эксперимента. Конечно, настоящее исследование влияния экстракта на иммунную систему носило весьма ограниченный характер с учетом количества и ряда определяемых показателей, сроков их анализа и использованных методов, но тем не менее полученные результаты позволяют оценить некоторые эффекты данного продукта. Иммуносупрессивное действие самих трихинелл хорошо известно. Главное условие взаимоотношений в системе «паразит — хозяин» — наличие у гельминтов механизмов защиты от воздействия иммунной системы хозяина, механизмов иммуномодуляции вплоть до полной иммунодепрессии. Продукты трихинелл являются непосредственными своеобразными «проводниками и исполнителями» таких эффектов и позволяют им «ускользнуть от надзора иммунной системы» хозяина.

Как уже отмечалось выше, с учетом наличия антипролиферативных свойств данного продукта возникла необходимость в исследования его влияния на иммунный статус мышей. Такое исследование представляет особой интерес, поскольку, по мнению некоторых авторов, противоопухолевое действие трихинелл ассоциируется именно с влиянием на иммунную систему. Иммуносупрессивное действие экстракта трихинелл на клеточное звено иммунитета связываем с цитотоксическим действием метаболитов трихинелл, входящих в состав испытуемого соматического экстракта.

Конечно, влияние испытуемого экстракта на иммунный статус является существенно более сложным, чем просто реакции, которые использовали в исследовании. Однако, на взгляд авторов, иммуносупрессивное действие экстракта хорошо согласуется с его антипролиферативным действием и его установление поможет в понимании механизма этого феномена.

Выводы

Согласно результатам комплексной оценки гуморального и клеточного иммунитета с использованием специфических показателей и данных микроскопического анализа органов, можно сделать вывод о иммуносупрессивном действии соматического экстракта трихинелл с преимущественным влиянием в отношении клеточного иммунитета.

На 8-е сутки после однократного введения экстракта имела место тенденция к снижению индекса ГЗТ (3,44 ± 0,78% у опытных животных относительно 5,17 ± 0,76% у животных контрольной группы). На 21-е сутки тенденция к угнетению клеточного иммунного ответа усилилась как после однократного, так и после шестикратного введения испытуемого экстракта трихинелл, индекс ГЗТ равнялся, соответственно, 4,81 ± 0,50% и 4,22 ± 0,56% по сравнению с 7,57 ± 1,72% в контроле. Восстановление данных показателей можно ожидать в более поздний срок.

Возможно, угнетение клеточного иммунного ответа связано с цитотоксическим действием соматического белкового экстракта T. spiralis на клетки, в том числе и на клетки иммунной системы.

Об авторах

Гелла Владимировна Коновалова1, 2, заведующая отделом

g.konovalova@vgnki.ru https://orcid.org/0000-0001-5306-7303

Каринэ Гегамовна Курочкина1, доктор ветеринарных наук

kar.kur.49@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2738-8853,

1 Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений — филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук, ул. Большая Черемушкинская, 28, Москва, 117218, Россия

2 Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, Звенигородское шоссе, 5, Москва, 123022, Россия